متدها چطور می بایست صحه گذاری شوند؟

متدها چطور می بایست صحه گذاري شوند؟

چه کسانی صحه گذاری متد را انجام می دهند؟

رویکردهای صحه گذاری متد

بعد از آن که توسعه متد اولیه به پایان رسید، آزمایشگاه باید روش اجرایی اندازه گیري را با جزئیات مربوطه مستند کند و در پایان این روش اجرایی مستند شده است که مبناي صحه گذاري رسمی قرار می گیرد.

دو رویکرد اصلی به صحه گذاري متد وجود دارد:

رویکرد مقایسه بین آزمایشگاهی و رویکرد آزمایشگاه تک.

بدون ملاحظه این که کدام رویکرد به کار گرفته شود، مسئولیت ایجاد اطمینان برازندگی متد براي استفاده ي مورد نظر و در صورت لزوم، اجراي کار بیشتر جهت تکمیل داده هاي صحه گذاري موجود، بر عهده خود آزمایشگاه استفاده کننده متد است.

 

رویکرد بین آزمایشگاهی

تاکنون مقاله هاي علمی زیادي در رابطه با صحه گذاري متد از طریق مقایسه هاي بین آزمایشگاهی اختصاصی که اغلب با نام «مطالعات مشترك» یا «مطالعات جمعی» از آن ها یاد می شود، منتشر شده است. چندین پروتوکل مرتبط با این همینطور،  صحه گذاري نوع استانداردهاي 5725 ISO در این زمینه وجود دارند که می توان آن ها را به عنوان پرکاربرد ترین پروتوکل هاي عمومی در نظر گرفت. اگر متدي در حال توسعه باشد که در آینده داراي استفاده وسیعی باشد، مثلاً به شکل یک روش اجرایی استاندارد منتشر شده، در این صورت احتمالاً یک مطالعه مشترك، شامل گروهی از آزمایشگاه ها می تواند روش ترجیحی صحه گذاري باشد. نشان داده شده که متد منتشر شده ي صحه گذاري شده بدین روش، یک متد محکم است. اطلاعات منتشر شده معمولا شامل دقت (تکرارپذیري، تجدید پذیري و/ یا حدود دقت متناظر) و بعضی اوقات تخمین هاي بایاس می باشند. جایی که یک متد از سوي استانداردهاي تصویب شده سازمان هاي بین المللی نظیر ISO ،CEN یا AOAC صحه گذاري شده باشد، در این صورت لازم است کاربر فقط داده هاي عملکردي منتشره را تصدیق و/ یا داده هاي عملکردي را براي استفاده خودشان از متد ایجاد کنند. در نتیجه، این رویکرد حجم کاري آزمایشگاه براي استفاده از متد را کاهش می دهد.

رویکرد آزمایشگاه تک

بعضی اوقات آزمایشگاه ها متوجه می شوند که به متدي نیاز دارند اما این متد به شکل یک استاندارد منتشر شده در دسترس آنها نمی باشد. اگر متد براي استفاده در یک آزمایشگاه توسعه یابد، براي مثال، به خاطر این که توجه همگانی به متد وجود نداشته یا به خاطر این که دیگر آزمایشگاه ها رقیب به حساب می آیند، رویکرد آزمایشگاه تک مناسب می باشد.

این که آیا متدهاي صحه گذاري شده در یک آزمایشگاه براي اهداف نظارتی قابل قبول خواهند بود یا خیر به دستورالعمل هاي پوشش دهنده بخش اندازه گیري بستگی دارد. معمولاً اخذ یک بیانیه خط مشی شفاف از مجموعه نظارتی مناسب، می بایست امکان پذیر باشد.

 

گستردگی مطالعات صحه گذاری 

آزمایشگاه در مورد این که لازم است کدام مشخصه هاي عملکردي جهت صحه گذاري متد بررسی شوند و در بعضی موارد در مورد میزان جزئیات بررسی یک مشخصه عملکردي تک نیز می بایست تصمیم گیري کند. پروتوکل آیوپاك  فهرست تعدادي از وضعیت ها را نشان می دهد که در میان آن ها، وضعیت متد و صلاحیت آزمایشگاه را نیز لحاظ می کند.

براي یک سازمان یا بخش، هر جا که دامنه کاربرد آنالیز به خوبی تعریف شود و کاربردهاي آن نیز با گذشت زمان شبیه یکدیگر باشند، صدور دستورالعمل هاي کلی براي میزان مطالعات صحه گذاري امکان پذیر می باشد. مثالی از بخش دارویی در جدول 3 نشان داده شده است.

شروع کار با ویژگی تجزیه اي دقیق که در دامنه کاربرد روش اجرایی مستند ارائه می شود، مبناي خوبی را براي برنامه ریزي فرایند صحه گذاري فراهم می کند، هر چند نشان داده شده که در عمل این وضعیت همیشه امکانپذیر نیست. در اینجا ارزیابی عملکرد متد ممکن است محدود شود.

این موضوع در IEC/ISO 17025 بند 5.4.5.3 بدین شکل اعلام می شود، صحه گذاري همیشه توازن بین هزینه ها، خطرات و امکانات فنی می باشد.

در این زمینه آزمایشگاه می بایست تمام تلاش خود را علی رغم محدودیت هاي تحمیل شده به کار گرفته و الزامات نظارتی، الزامات مشتري، تجربه موجود از متد، ابزارهاي در دسترس  و همینطور ضرورت سازگاري اندازه شناسی با دیگر متدهاي مشابهی که قبلاً درون آزمایشگاه یا دیگر آزمایشگاه ها استفاده میشده را نیز در نظر داشته باشد. بعضی از مشخصه هاي عملکردي ممکن است به طور تقریبی هنگام مرحله توسعه متد یا اجراي متد تعیین شده باشند. اغلب انجام یک مجموعه خاص از آزمایش ها به اطلاعاتی در رابطه با چند مشخصه عملکردي منجر می شوند، لذا با برنامه ریزي دقیق، تلاش لازم جهت کسب اطلاعات ضروري می تواند به حداقل رسانده شود. 

پیامدهاي محدودیت هاي بحث شده در بالا، به خصوص جایی که قرار نیست از متد به شکل روتین استفاده شود، بحرانی می باشند. پروسه ي صحه گذاري متدهایی که قرار است به صورت روتین استفاده شوند، به خوبی تعریف شده اند. آشکار است که براي آنالیز خاص نیز همانند آزمایش روتین اصول یکسانی به کار می روند. داشتن سطح مناسب اطمینان از نتایج تولید شده الزامی می باشد. ایجاد تعادل بین محدودیت هاي زمانی و هزینه ها و ضرورت صحه گذاري متد مشکل است. در بعضی شرایط، بستن قرارداد با پیمانکار فرعی و ارجاع آنالیزها به آزمایشگاه دیگر که آنالیزها در آنجا می توانند به شکل روتین انجام شوند، ممکن است مناسب تر باشد.

 

طرح و گزارش صحه گذاري 

کار صحه گذاري می بایست بر اساس یک روش اجرایی مستند اجرا و نتایج آن گزارش شوند. طرح کلی برنامه صحه گذاري («پروتوکل صحه گذاري») و گزارش صحه گذاري ممکن است در دستورالعمل هاي مربوط به بخش مورد نظر بیان شده باشند . مجموعه هاي تایید صلاحیت ملی ممکن است به حداقل الزامات لازم براي این مستندسازي اشاره کرده باشند. با این حال، یک الگوي ساده براي طرح صحه گذاري ترکیبی و گزارش صحه گذاري می تواند، براي مثال شامل بخش هاي زیر باشد:

• عنوان: این بخش می بایست متد، زمان و شخص اجراکننده کار را معرفی کند. اطلاعات مختصري درباره دامنه کاربرد متد و شرح مختصر متد، همینطور جزئیات وضعیت متد (براي مثال، یک استاندارد بین المللی، متد توسعه یافته درون سازمانی و غیره)، آنالیت، اندازه ده، واحد اندازه گیري، انواع نمونه و استفاده مورد نظر می بایست ارائه شوند. نمونه برداري و زیر نمونه برداري می تواند بخشی از روش اجرایی اندازه گیري باشد، که در اینگونه موارد، آن ها نیز می بایست صحه گذاري شوند. حتی اگر این مراحل در جاي دیگري انجام شده باشند، گنجاندن اطلاعات مربوط به آنها در طرح/ گزارش صحه گذاري مفید است.
• طرح ریزي: این بخش می بایست طرح کلی هدف، براي مثال صحه گذاري کامل یک متد جدید، تصدیق عملکرد یک متد استاندارد شده، دامنه کاربرد متد و غیره را بیان کند. به گستره ي کاري صحه گذاري، یعنی مشخصه هاي عملکردي مورد بررسی و هرگونه الزامات مرتبط نیز می بایست اشاره شود.
• مشخصه هاي عملکردي: در این بخش می بایست توصیف مختصري از ویژگی عملکردي و تکرار هرگونه الزام خاص و طرح کلی آزمایش هایی را که قرار است انجام شوند، همینطور چگونگی ارزیابی نتایج ارائه شوند. نتایج و نتیجه گیري هاي به دست آمده از آزمایش ها نیز می بایست بیان شوند. براي هر مشخصه عملکردي بخش هاي جدا مورد استفاده قرار می گیرند.

خلاصه: بخش آخر می بایست خلاصه اي از کار صحه گذاري و نتایج آن را ارائه دهد. پیامدهاي ضمنی مربوط به استفاده روتین، کنترل کیفیت داخلی و خارجی می بایست ارائه شوند، و مهمتر از همه در مورد برازندگی هدف متد نیز می بایست یک بیانیه نهایی ارائه شود. توجه داشته باشید که این موضوع در 17025 IEC/ISO یک الزام است.

ابزارهاي صحه گذاری 

بلانک ها

استفاده از انواع مختلف بلانک ها ما را در ارزیابی این که چه مقدار از سیگنال اندازه گیري شده قابل استناد به آنالیت و چه مقدار از آن قابل استناد به علل دیگر می باشد، توانمند می سازد. انواع مختلف بلانک در دسترس تجزیه گر وجود دارند:

• بلانک هاي واکنشگر: واکنشگرهاي استفاده شده حین فرایند تجزیه (شامل حلال هاي مورد استفاده براي استخراج یا انحلال) جهت تعیین این که آیا آن ها سهمی در سیگنال اندازه گیري شده دارند یا خیر، آنالیز می شوند.
• بلانک هاي نمونه: در اصل ماتریکس هاي نمونه بدون حضور آنالیت  ، براي مثال، نمونه ادرار انسان بدون یک ماده ي مخدر خاص یا نمونه گوشت بدون باقی مانده هاي هورمونی. ممکن است به دست آوردن نمونه هاي بلانک مشکل باشد، اما وجود چنین موادي براي ارائه تخمین واقع بینانه از مزاحمت هایی که ممکن است در آنالیز نمونه هاي آزمایشی مشاهده شوند، ضروري و لازم می باشند.

 

نمونه های آزمایشی روتین 

نمونه هاي آزمایشی روتین به خاطر فراهم آوردن اطلاعاتی در رابطه با دقت، مزاحمت ها و غیره که میتوانند به شکل واقع بینانه در کار روزانه مشاهده شوند، مفید هستند. چنانچه غلظت آنالیت یک ماده آزمایشی به طور صحیح معلوم باشد، از آن می توان براي ارزیابی بایاس اندازه گیري استفاده کرد. ارزیابی صحیح مقدار آنالیت می تواند با استفاده از یک متد مرجع به دست آید، هر چند چنین متدهایی همیشه در دسترس نیستند. 

مواد/ محلول هاي نشانه دار

مواد یا محلول هایی هستند که آنالیت(ها)ي مورد نظر به شکل عمدي به آن ها اضافه شده اند. از آنجا که این مواد یا محلول ها ممکن است از قبل داراي آنالیت مورد نظر باشند، براي اطمینان از این که نشانه گذاري به سطوح آنالیت خارج از گستره ي کاري متد منجر نشود، می بایست احتیاط لازم صورت گیرد.   با مقدار معلوم از آنالیت، باعث افزایش پاسخ آنالیت در اندازه گیري می شود و اگر حتی مقادیر مطلق آنالیت حاضر، قبل و بعد از افزایش نشانه معلوم نباشند، محاسبه غلظت آنالیت بر اساس مقدار افزوده شده انجام خواهد شد. توجه داشته باشید که در بیشتر متدهاي نشانه گذاري، آنالیت به شکلی اضافه می شود که به اصطلاح خیلی به ماتریکس نمونه نچسبد؛ وضعیتی که در حالت حضور طبیعی آنالیت مشاهده نمی شود. لذا انتظار می رود که تخمین هاي بایاس به دست آمده با نشانه گذاري خیلی خوش بینانه باشند.

نشانه گذاري نمی بایست الزاماً به آنالیت مورد نظر محدود شود، بلکه می تواند شامل هر چیزي باشد که جهت اندازه گیري اثر افزایش به نمونه افزوده می شود. براي مثال، جهت قضاوت در مورد غلظت عامل مزاحم که در آن غلظت، تعیین آنالیت به طور نامطلوبی تحت تأثیر قرار می گیرد، نمونه می تواند با مقادیر متغیر از یک مزاحمت خاص نشانه گذاري شود. آشکار است که در اینجا طبیعت نشانه نیز می بایست شناخته شود.

 

مواد بار شده

موادي هستند که در آن ها، آنالیت مورد نظر در اصل بیگانه به حساب می آید و در نقطه اي قبل از نمونه برداري ماده وارد توده شده است. بنابراین آنالیت در مقایسه با افزایش نشانه، در این وضعیت بیشتر به ماتریکس چسبیده است. مقدار آنالیت، به مقادیر آنالیت در تماس با ماده، آهنگ جذب و واجذب آن از ماتریکس و دیگر اتلاف ها از طریق متابولیسم، فروپاشی خود به خودي یا دیگر پروسه هاي شیمیایی یا فیزیکی وابسته خواهد بود. سودمندي نمونه هاي بارشده براي اهداف صحه گذاري به این بستگی دارد که تا چه اندازه بتوان مقدار آنالیت را مشخص کرد. موارد زیر مثال هایی از مواد بار شده هستند:

1 .علفکش ها در آرد غلات، که حین رشد اسپري می شوند.

2 .اجزاي سازنده فعال در فرمولاسیون هاي فرآورده هاي دارویی که در مرحله فرمولاسیون اضافه می شوند.

3 .پودر سفیده تخم مرغ (با مقدار پروتئین معلوم) که هنگام بررسی آلرژن ها، قبل از پخت به خمیر کوکی اضافه می شود.

استانداردهای اندازه گیری

هنگام ارجاع به «استانداردها» می بایست احتیاط کرد، چرا که این اصطلاح معمولا براي سندهاي مکتوب، نظیر استانداردهاي ISO به کار می رود. جایی که این اصطلاح به مواد مورد استفاده براي کالیبراسیون یا اهداف شناسایی اشاره می کنند، بهتر آن است که استانداردهاي اندازه گیري یا کالیبران/ کالیبراتورها نامیده شوند. این مواد به طور سنتی محلول هاي مواد تک در نظر گرفته می شوند، اما در عمل آن ها می توانند هر چیزي باشند که در آن یک پارامتر خاص یا خاصیت توصیف شده بتواند به عنوان یک مرجع اندازه شناسی به کار رود.

تشخیص بین مواد مرجع (RM) و مواد مرجع گواهی دار (CRM)، به خاطر تفاوت عمده اي که در چگونگی استفاده آن ها در پروسه ي صحه گذاري متد وجود دارد، مهم است. RMها می توانند تقریباً هر ماده اي باشند که به عنوان یک مبنا براي مرجع مورد استفاده قرار می گیرند و عملا شامل واکنشگرهاي آزمایشگاهی با خلوص معلوم، مواد شیمیایی صنعتی یا دیگر دست ساخته ها می باشند. لازم است تا خاصیت یا آنالیت مورد نظر پایدار و همگن باشد، اما ضرورتی وجود ندارد که آن ماده داراي میزان بالاي توصیف ویژگی، قابلیت ردیابی اندازه شناسی، عدم قطعیت و سند سازي مرتبط با CRMها باشد.

معمولاً در توصیف پارامتر مورد نظر در یک CRM در مقایسه با یک RM سخت گیري و کنترل بیشتري وجود دارد، به علاوه، مقدار ارائه شده در CRM با قابلیت ردیابی اندازه شناسی و عدم قطعیت مستند شده گواهی می شود. معمولا تعیین ویژگی با استفاده از چندین متد مختلف و یا یک روش اندازه گیري اولیه تک انجام می شود، بدین ترتیب تا آنجا که امکان دارد، هرگونه بایاس احتمالی در تعیین ویژگی کاسته یا حتی حذف می شود. براي ارزیابی بایاس به یک نقطه مرجع قابل اعتماد، ترجیحاً یک CRM با ماتریکس و غلظت هاي آنالیت یکسان، همانند نمونه هاي آزمایشی نیاز می باشد.

 

علم آمار

متدهاي آماري براي خلاصه سازي داده ها و ارائه قضاوت هاي عینی در رابطه با اختلاف هاي بین مجموعه هاي داده ها (آزمون هاي معناداري) ضروري می باشند. تجزیه گرها می بایست حداقل با اصول پایه تئوري آمار، به خصوص جهت ارزیابی دقت، بایاس، گستره ي خطی، LOD و LOQ و عدم قطعیت اندازه گیري آشنا باشند. تعدادي از کتاب هاي مفید و مقدماتی آمار براي شیمی تجزیه در پیوست معرفی شده اند.

 

الزامات صحه گذاري

الزامات چگونگی اجراي صحه گذاري متد ممکن است در دستورالعمل هاي درون بخش خاص مرتبط با متد مشخص شوند. جایی که یک چنین الزاماتی وجود داشته باشد، پیشنهاد می شود که از آن ها تبعیت شود. این وضعیت، این اطمینان را ایجاد می کند که واژه شناسی صحه گذاري خاص، همراه با آماره هاي استفاده شده به شکلی تفسیر شوند که با بخش مرتبط سازگار باشند. ممکن است در تایید رسمی یک متد جهت توصیف الزامات به مطالعه مشترك نیاز باشد.

 

فرایند صحه گذاري متد

آزمایشگاه هنگام مواجه با یک مشکل خاص مربوط به مشتري، ابتدا می بایست الزام آنالیزي مشخصه هاي عملکردي متد را که می بایست مشکل را حل کنند، تعریف و تنظیم کند (شکل 1).

در پاسخ به این الزامات، آزمایشگاه می بایست یک متد موجود و مناسب را شناسایی و یا چنانچه لازم باشد یک متد را توسعه/ و یا اصلاح کند. توجه داشته باشید که بعضی مقررات ممکن است براي پیگیري به متد خاصی نیاز داشته باشند. جدول 4 ،نوع پرسش هایی را که ممکن است در تدوین یک الزام تجزیه مطرح شوند (ستون 1) و مشخصه هاي عملکردي متناظر متد را که ممکن است نیاز به ارزیابی داشته باشند (ستون 2) نشان می دهد.

آزمایشگاه مشخصه هاي عملکردي مرتبط را شناسایی و ارزیابی کرده و سپس آن ها را در برابر الزام تجزیه اي بازبینی می کند. فرایند صحه گذاري با این نتیجه گیري و بیانیه به پایان می رسد که آیا الزام تجزیه اي برآورده شده است یا خیر. اگر الزام تجزیه اي برآورده نشود، توسعه بیشتر متد ضروري خواهد بود. این فرایند توسعه و ارزیابی آنقدر ادامه پیدا می کند تا این که متد قادر به برآورده نمودن آن الزام باشد.

در واقعیت، یک الزام تجزیه اي به ندرت با خواسته مشتري از قبل به صورت یک روش رسمی مطابقت دارد. مشتري ها معمولاً الزاماتشان را بر مبناي قیمت و/ یا زمان تعریف کرده و به ندرت از نحوهي اجراي مناسب متدها مطلع هستند. با این حال، در جایی که متدها از یک الزام نظارتی حمایت کرده و یا وقتی که انطباق با یک مشخصه مطرح باشد، الزامات عملکردي متدها نیز میتوانند تعیین شوند. براي مثال، اتحادیه اروپا الزاماتی را جهت آنالیز آب آشامیدنی ، به منظور اجراي آنالیزها در دستورالعمل چارچوب آب ، همینطور الزاماتی را جهت تعیین سطوح پسماندهاي داروهاي دامپزشکی در غذاهاي با منشأ حیوانی و باقی مانده هاي آفت کش ها در غذا و خوراك دام منتشر کرده است. با این حال، معمولاً تصمیم گیري در مورد این که چه عملکردي لازم است، به صلاح دید تجزیه گر بستگی خواهد داشت. اغلب این به معناي تنظیم یک الزام تجزیه اي هم جهت با قابلیت معلوم متد (براي مثال، به شکل منتشر شده در متدهاي استاندارد، به شکل نتایج مشاهده شده در برنامه هاي آزمون مهارت (PT) یا تخمین زده شده از مدل هاي ریاضی نظیر تابع هورویتز می باشد.

ممکن است توسعه متدي که یک الزام تجزیه اي خاص را برآورده می سازد، از لحاظ محدودیت هاي مالی یا از نظر اقتصادي امکان پذیر نباشد. در هر حال، می بایست بین آسان گیري یک الزام آنالیزي تا رسیدن به سطح قابل دسترس و یا تفکر مجدد در مورد توجیه آنالیز انتخابی تصمیم گیري شود.